代謝副產(chǎn)物乙酸對大腸桿菌發(fā)酵的影響及解決方法

生物技術(shù)研究者追求的兩個(gè)主要目標，一是新型生物產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，另一就是為傳統的或新生生物產(chǎn)品，尋求更經(jīng)濟的生產(chǎn)方式。近十年來(lái)，利用遺傳工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)一些重要的生物藥物，是生物技術(shù)領(lǐng)域中迅速發(fā)展的一個(gè)重要方向。在這一研究領(lǐng)域里，如何創(chuàng )造更經(jīng)濟、更有效的方法，來(lái)提高生產(chǎn)過(guò)程的經(jīng)濟性和產(chǎn)品的市場(chǎng)競爭力，已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域的科學(xué)家們所關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。
   利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)重要的生物藥物，在人類(lèi)文明史上具有劃時(shí)代的意義。由于生產(chǎn)成本和生產(chǎn)率的高低直接影響公司的生存，重組生物藥物生產(chǎn)過(guò)程的優(yōu)化已經(jīng)成為一個(gè)重要問(wèn)題。它包括以下六個(gè)方面∶(1)適宜宿主的選擇；(2)重組蛋白積累位點(diǎn)(如可溶的胞內積累、胞內聚合積累、周質(zhì)積累或胞外積累)的確定；(3)重組基因最大表達的分子策略；(4)細胞生長(cháng)和生產(chǎn)環(huán)境的優(yōu)化；(5)發(fā)酵條件的優(yōu)化；后處理過(guò)程的優(yōu)化。只有這六個(gè)方面都以實(shí)現高生產(chǎn)率為目標，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的最優(yōu)化才能實(shí)現。

(一)細胞生長(cháng)環(huán)境的優(yōu)化策略
要提高細胞密度和生產(chǎn)率，首先需要對微生物生長(cháng)的物理和化學(xué)環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化，包括生長(cháng)培養基的組成，培養物理參數(pH、溫度和攪拌)及產(chǎn)物誘導條件。優(yōu)化這些參數的目的在于保證細胞生長(cháng)處于最適的環(huán)境條件之下，避免營(yíng)養物過(guò)量或不足、防止產(chǎn)物降解以及減少有毒產(chǎn)物的形成。
1．培養基組成的優(yōu)化
培養基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微營(yíng)養物如維生素和微量元素，這些營(yíng)養物的濃度與比例，對實(shí)現生產(chǎn)重組微生物的高密度發(fā)酵是很重要的。例如，過(guò)量的Fe2+和CaCO3與相對低濃度的磷酸鹽可促進(jìn)黃曲霉生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸；鏈霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其絲氨酸蛋白酶生產(chǎn)能力可提高10倍之多；在重組微生物達到高細胞密度后，限制磷酸鹽濃度可使抗生素和異源白介素b的產(chǎn)率顯著(zhù)提高。此外還發(fā)現，限制精氨酸的濃度雖然會(huì )抑制細胞的生長(cháng)，但比起精氨酸充足時(shí)細胞生長(cháng)優(yōu)良的情況，其重組a-淀粉酶的產(chǎn)量可提高2倍。
培養基中復合氮源的種類(lèi)對重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵也非常重要。一般地，當流加培養基中含有酵母膏時(shí)，重組蛋白不穩定；而當流加培養基中含有蛋白胨時(shí)，大腸桿菌不能再利用其所產(chǎn)生的乙酸。將酵母膏和蛋白胨都加入流加培養基中，不但所生產(chǎn)的重組蛋白非常穩定，細胞還能再利用代謝合成的乙酸，這是一種非常有趣的代謝機制。
恒化技術(shù)可用于優(yōu)化精氨酸營(yíng)養缺陷型大腸桿菌X90的生長(cháng)培養基。使該菌株以0.4 h-1的比生長(cháng)速率在含精氨酸的基本培養基上生長(cháng)，待培養達到穩定狀態(tài)后，在恒化器內分別加入氨基酸、維生素和微量元素來(lái)考察這些物質(zhì)對菌體生長(cháng)和精氨酸合成的影響。結果表明，由于氨基酸生物合成途徑的末端產(chǎn)物抑制作用，加入某些氨基酸后，細胞生長(cháng)反而受到抑制。加入NH4Cl后細胞量則出現了戲劇性的增長(cháng)。而添加維生素對菌體生長(cháng)基本上沒(méi)有任何影響。通過(guò)計算生物量對每種基質(zhì)的產(chǎn)率，最終可以確定高密度發(fā)酵培養基的組成，在此優(yōu)化培養基上，大腸桿菌X90細胞密度可達到92 g/L，同時(shí)形成56 mg/L的胞外重組蛋白酶。
2．特殊營(yíng)養物的添加
在某些情況下，向培養基中添加一些營(yíng)養物質(zhì)能提高生產(chǎn)率。這些營(yíng)養物的作用有可能是作為產(chǎn)物的前體，也有可能是阻止產(chǎn)物的降解，例如，在培養重組大腸桿菌生產(chǎn)氯霉素乙酰轉移酶(一種由許多芳香族氨基酸組成的蛋白)時(shí)添加苯丙氨酸，可將酶的比活力提高大約2倍；在培養重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)b-內酰胺酶的培養基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸鉀能使重組蛋白的穩定性顯著(zhù)提高。其原因可能是由于宿主細胞產(chǎn)生的多種胞外蛋白酶的活性被抑制，從而防止了重組蛋白的降解。
在生長(cháng)培養基中添加特殊物質(zhì)有時(shí)還能以一種未知的機制提高生產(chǎn)率。例如，在搖瓶培養Micromonospora cbersina時(shí)添加碘化鈉可使dynemicin A的產(chǎn)量提高35倍，但在小型反應器中卻無(wú)法重復這一結果。
3．限制代謝副產(chǎn)物的積累
培養條件的控制對代謝副產(chǎn)物的形成影響甚大。在分批或流加培養中，某些營(yíng)養物的濃度過(guò)高均會(huì )導致Crabtree效應的產(chǎn)生。在這種效應下，釀酒酵母會(huì )產(chǎn)生乙醇，大腸桿菌則會(huì )產(chǎn)生過(guò)量乙酸，一旦生成乙酸，細胞生長(cháng)及重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì )受到抑制。大腸桿菌形成乙酸的速度依賴(lài)于細胞的生長(cháng)速度和培養基的組成。業(yè)已確證，如果在培養基中添加復合營(yíng)養物(如大豆水解物)，則會(huì )增加乙酸的積累量。針對如何減輕由于乙酸積累而產(chǎn)生的負面影響，眾多研究者進(jìn)行了大量工作，如利用循環(huán)發(fā)酵技術(shù)來(lái)限制乙酸在重組大腸桿菌高密度培養中的積累。近來(lái)也有研究表明，添加某些氨基酸能減輕乙酸的抑制作用。如在培養基中添加10 mg/L的甘氨酸能顯著(zhù)促進(jìn)大腸桿菌合成重組a-淀粉酶和b-內酰胺酶，并能刺激酶從周質(zhì)向培養基中釋放，但此時(shí)仍有乙酸伴隨生成。
 

(二)培養模式

由于許多營(yíng)養物在高濃度下對細胞有抑制作用，而為了達到高細胞密度，又必須供給大量的營(yíng)養物質(zhì)，因此，濃縮營(yíng)養物必須以與其消耗速率成比例的速度加入反應器中。為此產(chǎn)生了多種形式的補料策略，它可以簡(jiǎn)單到線(xiàn)性補料，也可以復雜到利用數學(xué)模型計算得出的策略來(lái)控制補料速率。具體來(lái)說(shuō)，培養模式的選擇主要依賴(lài)于以下三個(gè)因素∶(1)所培養細胞的具體代謝行為；(2)利用抑制性底物合成目的產(chǎn)物的潛力；(3)誘導條件以及測量細胞培養各項參數的能力。
1．大腸桿菌流加發(fā)酵策略
大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，廣泛用于基因工程的研究中。大腸桿菌高密度培養時(shí)最關(guān)鍵的問(wèn)題是如何盡量減少乙酸的產(chǎn)生，因為高濃度葡萄糖或高比生長(cháng)速率帶來(lái)的高濃度乙酸會(huì )嚴重抑制細胞生長(cháng)和重組蛋白的生產(chǎn)。研究發(fā)現，即使葡萄糖濃度只有0.25～0.5 g/L，大腸桿菌仍會(huì )產(chǎn)生乙酸。因此，高細胞密度發(fā)酵所采用的流加策略必須按照一定的算法制定，以保持反應器中底物濃度處于較低的水平。營(yíng)養物最好以它們的消耗速率加入反應器中，這樣不僅可以防止底物積累到毒性水平，也不會(huì )使細胞處于饑餓狀態(tài)。
近年來(lái)已經(jīng)報道了多種控制大腸桿菌流加培養中流加速率的方法，其中大多數是將流加速率與一種物理參數間接耦合(如溶氧、pH或CO2釋放速率)。有學(xué)者將溶氧控制在一個(gè)預定值上以保證較低的生長(cháng)速率，結果乙酸產(chǎn)生很少，最終細胞干重達到110 g/L，并發(fā)現較低的比生長(cháng)速率還有利于重組蛋白的高表達。在另一個(gè)控制低比生長(cháng)速率的高細胞密度培養中，研究者采用先指數流加葡萄糖、銨鹽和無(wú)機鹽，后采用廣義線(xiàn)性流加的培養策略，有效地防止了乙酸的積累，重組大腸桿菌的細胞密度達到66 g/L，通過(guò)溫度誘導可在胞內形成19.2 g/L的活性重組蛋白。
如果將葡萄糖濃度控制在一個(gè)不致于產(chǎn)生毒性的足夠低的水平上，也可以使細胞在不存在限制性基質(zhì)的情況下迅速生長(cháng)到高細胞密度。這種控制策略對儀器的要求較高。Kleman等采用在線(xiàn)葡萄糖分析儀，以微生物對葡萄糖的需求來(lái)決定葡萄糖和其它營(yíng)養物的流加速率，這一算法能夠在產(chǎn)物誘導階段中根據細胞生長(cháng)的變化自動(dòng)調整流加速率。培養攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌 MV1190，其質(zhì)粒中帶有編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最終細胞干重達到39 g/L，產(chǎn)生1.7 g/L可溶的活性蛋白。
2．重組酵母的流加發(fā)酵
酵母中廣泛用于遺傳工程研究的菌株是釀酒酵母。但采用釀酒酵母作為重組宿主也有以下缺點(diǎn)∶(1)重組蛋白生產(chǎn)的水平較低；(2)質(zhì)粒不穩定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出現的，因為這會(huì )抑制重組蛋白的形成。近來(lái)研究表明，其它酵母，如巴斯德畢赤氏酵母也具有作為重組宿主的潛力。Clare等比較了重組巴斯德畢赤氏酵母和釀酒酵母在高細胞密度狀態(tài)下表達和分泌鼠表皮生長(cháng)因子的能力。培養每基因組含有19個(gè)拷貝數的巴斯德畢赤氏酵母，最終可獲得447 mg/L胞內重組蛋白；而培養釀酒酵母所獲得的最高水平僅6～7 mg/L。
通過(guò)先指數流加，后采用基于CO2釋放和RQ值的線(xiàn)性流加控制方式可使重組巴斯德畢赤氏酵母的細胞干重達到80～90 g/L，并分泌高水平的重組人血清蛋白。而培養釀酒酵母，細胞干重和重組蛋白的產(chǎn)量?jì)H分別為25 g/L和20 mg/L。即使將釀酒酵母的生長(cháng)速率維持在0.12～0.18 h-1，也將形成10～13 g/L的乙醇，因而導致產(chǎn)率降低。但釀酒酵母產(chǎn)乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一個(gè)復雜的流加系統，將酵母的生長(cháng)速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生產(chǎn)最大而乙醇的生成最小。
3．流加培養的控制
一個(gè)好的流加控制系統必須避免兩種傾向∶一是流加過(guò)量，補料組分在反應器中積累從而對細胞生長(cháng)和產(chǎn)物形成產(chǎn)生抑制；二是流加不足，這可能會(huì )導致細胞必需營(yíng)養物的缺乏。計算機技術(shù)的迅猛發(fā)展，為流加培養的控制提供了更有效的手段。近年來(lái)，應用計算機技術(shù)來(lái)監測和控制發(fā)酵過(guò)程的研究屢見(jiàn)報道。由于現代計算機技術(shù)的幫助，人們能夠采用多種生長(cháng)參數和數學(xué)模型來(lái)控制流加培養中營(yíng)養物的添加，從而使復雜的控制系統得以實(shí)現。在各種人工智能技術(shù)中，模糊推理(fuzzy reasoning)是應用最廣的一種。模糊邏輯控制(fuzzy logic control)部分依賴(lài)于數學(xué)生長(cháng)模型，也采用“語(yǔ)言定義的規則系統”(linguistically defined rules system)來(lái)幫助系統響應發(fā)酵過(guò)程的非線(xiàn)性和動(dòng)態(tài)行為。Alfafara等在流加培養釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的研究中，采用一個(gè)模糊邏輯控制系統來(lái)控制葡萄糖的流加速度，對系統進(jìn)行優(yōu)化后谷胱甘肽的比產(chǎn)生速率達到6.2 h-1。目前，在流加培養中應用模糊邏輯控制技術(shù)的最大問(wèn)題在于如何減少底物和產(chǎn)物濃度振蕩所需的調整次數。自適應模糊邏輯控制算法的發(fā)展可望對此有所幫助。

   (三)誘導策略

對于許多帶有誘導型啟動(dòng)子的重組微生物，只有將生長(cháng)期和產(chǎn)物形成期分開(kāi)才能獲得最大生產(chǎn)率。在流加培養中，這兩段時(shí)期的分離可以通過(guò)延遲誘導直至細胞生長(cháng)已達到高密度來(lái)實(shí)現。此外，如果質(zhì)粒穩定并且產(chǎn)物對培養物無(wú)毒，那么可以用重復補料分批培養系統來(lái)提高生產(chǎn)率。有學(xué)者采用重復補料分批培養技術(shù)培養釀酒酵母，每24 h更換50%的培養基，持續30 d，其產(chǎn)物(hirudin)的產(chǎn)量可比連續培養系統提高3倍。

如果誘導物和產(chǎn)物對細胞都有毒性，那么應當人為地將誘導期和生長(cháng)期分開(kāi)。對于這種情況，兩級連續培養是最適宜的培養方式?？刂频谝还薜臈l件，使細胞生長(cháng)處于最適狀態(tài)之下，而誘導與產(chǎn)物形成則發(fā)生在第二罐中。例如，在恒化器中培養一株能產(chǎn)b-內酰胺酶的重組大腸桿菌，將第一罐的發(fā)酵液導入第二罐中，構成一個(gè)兩級培養系統。第二罐中添加營(yíng)養物以及IPTG作為誘導物。結果獲得300 mg活性b-內酰胺酶(相當于總蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。這一系統至少可以穩定運行50 d。另一相似的系統被用于培養大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白A-EcoRI蛋白融合體。培養在恒濁器中進(jìn)行，對第二罐進(jìn)行熱誘導，結果獲得了比分批發(fā)酵高6倍的比生產(chǎn)率。研究者還嘗試將生產(chǎn)重組蛋白的兩級連續培養系統與親和色譜柱相組合，試圖實(shí)現重組蛋白生產(chǎn)和純化的連續化。但由于技術(shù)上的一些原因，這種組合還未得到成功。
比生長(cháng)速率對細胞生長(cháng)和產(chǎn)物形成均有重要作用。經(jīng)常會(huì )遇到的情況是，最適于細胞生長(cháng)的比生長(cháng)速率卻并不適于產(chǎn)物的形成或其它特性的實(shí)現。我們在培養面包酵母時(shí)發(fā)現，比生長(cháng)速率為0.2 h-1時(shí)細胞產(chǎn)率最高，而比生長(cháng)速率為0.178 h-1時(shí)酵母發(fā)酵活力最佳。針對這一現象我們提出了一個(gè)兩階段控制比生長(cháng)速率的流加培養策略，結果在一個(gè)反應器中實(shí)現了高發(fā)酵活力與高細胞產(chǎn)率的統一。 (四)細胞循環(huán)發(fā)酵 從反應器角度來(lái)考慮獲得高細胞密度，通常采用的是細胞循環(huán)生物反應器。這種反應器利用一種切向流或中空纖維過(guò)濾器從醪液中分離細胞，細胞返回容器，無(wú)細胞醪液則以給定速率連續轉移，同時(shí)代之以新鮮培養基。利用細胞循環(huán)技術(shù)，可使細胞保留在反應器中并達到高細胞密度，而毒性廢產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物則不斷轉移，這可以延遲或防止由細胞生長(cháng)或產(chǎn)物形成引起的反饋抑制。細胞循環(huán)生物反應器能夠適用于多種機體和生產(chǎn)系統，但它的應用也存在許多限制，主要包括∶(1)作用于進(jìn)入過(guò)濾單元的細胞的剪應力太大；(2)系統的放大存在許多實(shí)際困難。
操作細胞循環(huán)生物反應器時(shí)必須考慮兩個(gè)因素，一是稀釋率(流速／體積)；二是循環(huán)速率(指通過(guò)過(guò)濾系統的培養基速率)。稀釋率的大小影響細胞的生長(cháng)速率，不同的實(shí)驗目的對稀釋率的要求也不同；高的循環(huán)速率可使組分混合均勻，特別適用于細胞容易凝聚或成團的情況。但循環(huán)速率過(guò)高會(huì )使作用在細胞上的剪切力過(guò)高，也會(huì )導致過(guò)濾單元膜的迅速損壞。因此，很難同時(shí)確定合適的稀釋率與循環(huán)速率，這也是限制細胞循環(huán)技術(shù)應用的一個(gè)重要因素。
細胞循環(huán)技術(shù)可望獲得高的體積生產(chǎn)率，這對產(chǎn)物的提取非常有利。近年來(lái)循環(huán)發(fā)酵技術(shù)已廣泛用于生產(chǎn)細胞代謝物，如燃料酒精和有機酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用細胞循環(huán)發(fā)酵技術(shù)，重組大腸桿菌細胞干重達到145 g/L，其重組青霉素?；干a(chǎn)率比分批培養提高了近10倍。對于活細胞即為所希望的產(chǎn)物的培養，細胞循環(huán)發(fā)酵也能發(fā)揮作用。如在食品工業(yè)中，為生產(chǎn)牛奶，奶酪和酸乳酪需培養不同的乳桿菌，采用細胞循環(huán)生物反應器可以很容易地提高這些生物體的的密度。
在多種控制手段的幫助下，目前人們已經(jīng)能很容易地獲得超過(guò)100 g/L的細胞密度。但已有的研究結果表明，與最適生物量形成所對應的生長(cháng)條件通常會(huì )導致較低的比生產(chǎn)率。例如，用細胞循環(huán)反應器生產(chǎn)2,3-丁二醇，生物量提高了大約6倍，但體積生產(chǎn)率只提高了2～3倍。同樣，流加培養可以使鏈霉菌的細胞干重達到43 g/L，但蛋白酶活為零，而當細胞干重為18 g/L時(shí)蛋白酶活卻高達3500 U/mL。我們在研究中也經(jīng)常遇到類(lèi)似問(wèn)題。要解決這一問(wèn)題，一方面應當研究如何促進(jìn)重組蛋白的高效表達和提高重組菌株的穩定性，另一方面要研究與高細胞密度相關(guān)聯(lián)的高水平產(chǎn)物的形成條件。